NY_T 2811-2015 橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范
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ID： |
45BFBBC7508F44489D5D717E35591FF2 |
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0.73 |
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9 |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2811—2015,橡胶树棒抱霉落叶病病原菌分子检测技术,规范,Molecular detection for pathogen of Corynespora leaf fall disease of rubber tree,2015-10-09 发布 2015-12-01 实施,中华人民共和国农业部 发布,NY/T 2811—2015,**,刖 百,本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草,本标准由农业部农垦局提出,本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口,本标准起草单位:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,本标准主要起草人:谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、喻群芳、张辉强,I,NY/T 2811—2015,橡胶树棒抱霉落叶病病原菌分子检测技术规范,1范围,本标准规定了橡胶树棒施霉落叶病病原菌(Corjmes力ora cassMco/a)的术语和定义、检测方法、结果,判定、样品保存等技术要求,本标准适用于橡胶树的棒预霉落叶病病原菌的检测,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求,3术语和定义Z,下列术语和定义适用于本文件,3. 1,橡胶树棒施骞落叶病 corynespora leaf fall disease of rubber tree,由多主棒施霉cass%% (Berk, et Curt. ) Wei］引起的ー种为害橡胶树叶片和嫩梢,的真菌病害。该病害病原菌的学名、形态特征及其危害症状参见附录A,4检测方法,4. 1原理,根据橡胶树棒抱霉落叶病病原菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA- ITS)特有碱基序列设计特异,性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期272 bp的DNA片段,判断样品中是否携带橡胶树棒抱,霉落叶病病原菌,。、,4.2仪器,显微镜(10X40倍ヌ、高压灭菌锅、高速冷冻离心机(最大离心力25 000Xg)、PCR扩增仪、电泳仪及,紫外凝胶成像仪等,4. 3试剂及配制方法,4. 3. 1 1 mol/L Tris - HCl(pH 8. 0),称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris,优级纯)溶解于800 mL ー级超纯水中,用盐酸(HC1,分析,纯)调pH至8. 0,加超纯水定容至1 000 mLo分装后高温灭菌(121℃)20 min,4℃或室温保存备用,4. 3. 2 10 mol/L NaOH,称取80. 0 g氢氧化钠(NaOH,分析纯)溶解于160 mL ー级超纯水中,溶解后再加一级超纯水定容,到 200 mLo,4. 3. 3 1 mol/L EDTA-Na2(pH 8. 0),称取372. 2 g乙二铁四乙酸二钠(EDTA- Na?,优级纯),溶解于70 mL ー级超纯水中,再加入适量,NaOH溶液(4. 3. 2),加热至完全溶解后,冷却至室温,再用NaOH溶液(4. 3. 2)调pH至8. 0,加超纯水,定容至100 mL。分装后高温灭菌(121℃)20 min,4℃或室温保存备用,4.3.4 0r額提取液ヤ!18.0),1,NY/T 2811—2015,称取81. 9 g氯化钠（NaCl,分析纯）溶解于800 mL ー级超纯水中,缓慢加入20 g十六烷基三甲基澳,化镂（CTAB,优级纯）,加热并搅拌,充分溶解后加入100 mL Tris - HC1 （4. 3.1）,4 mL EDTA - Na2,（4. 3. 3）,加一级超纯水定容至1〇〇〇 mL,分装后高温灭菌（121 ℃）20 min,室温保存,研磨植物材料之,前加航基乙醇（分析纯）至体积分数为2%,4.3.5 CTAB沉淀液,称取2. 34 g NaCl（分析纯）溶解于800 mLー级超纯水中,缓慢加入50 g CTAB（优级纯）,加热并搅,拌,充分溶解后加一级超纯水定容至! 〇〇〇 mL,分装后高温灭菌（121 ℃）20 min,室温保存备用,4. 3. 6 1. 2 mol/L NaCl,称取70. 2 g NaCl（分析纯）溶解于800 mL ー级超纯水中,加一级超纯水定容至1 000 mL,分装后高,温灭菌（121 ℃）20 min,4 ℃或室温保存备用,4. 3.7 TE 缓冲液（pH 8.0）,分别量取 10 mL Tris - HC1（4. 3. 1）和 1 mL EDTA - Na? （4. 3. 3）,加一级超纯水定容至 1 000 mL,分装后高温灭菌（121 ℃）20 min,4 ℃或室温保存备用,4.3.8加样缓冲液,称取250. 0 mg澳酚蓝（化学纯）,加10 mL ー级超纯水,在室温下溶解12 h;称取250.。mg二甲基,苯月青蓝（化学纯）溶解于10 mL ー级超纯水中;称取50. 0 g蔗糖（化学纯）溶解于30 mL ー级超纯水中,混合以上3种溶液,加一级超纯水定容至100 mL,4 ℃或室温保存备用,4. 3. 9 50XTAE 电泳缓冲液（pH 8. 0）,称取242. 2 g Tris（优级纯）,先用500 mL ー级超纯水加热搅拌溶解后,加入!00 mL EDTA - Na2,（4. 3. 3）,用冰乙酸（分析纯）调pH至8. 0,然后加一级超纯水定容到1 000 mL。室温保存备用,使用时,用ー级超纯水稀释成1XTAE,4.3. 10 ……
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